2.GST融合蛋白不与磁珠结合，是什么原因造成的？

a. 超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与磁珠结合。需注意设置好超声仪的功率和间隔时间；  b. 在细胞裂解和加Binding Buffer和Elution Buffer之前，加入终浓度1–10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率； c. 由于pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低，因此使用前需用pH6.5～8.0的Buffer如PBS进行平衡；  d. 如果磁珠已

1.GST融合蛋白不能有效洗脱，是什么原因导致的？

a. 洗脱时间不足；  b. 增大Elution Buffer的洗脱体积； c. 加大Elution Buffer中还原型谷胱甘肽的浓度。谷胱甘肽的推荐浓度是10 mM，若此浓度洗脱效果不是很理想可以尝试50 mM Tris- HCl, 20–40 mM reduced glutathione, pH 8.0 的Elution Buffer； d. 增大Elution Buffer的pH值。Elu

16.His-tag蛋白不吸附或亲和力低是什么原因？

首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。 （1）有目标蛋白，但大量穿透： a、蛋白不含有标签或未能正确表达。 解决措施：Western Blot鉴定目标蛋白是否有His-Tag。若没有，需要重新构建载体，添加组氨酸标签，并确认标签正确表达。 b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露。 解决措施： 在样品和平衡缓冲缓冲液中加1-2M尿素，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不会变性。 在变性条件下纯

14.洗脱产物杂带多，是什么原因？

（1）杂蛋白吸附。由于组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等是蛋白质中很常见基团，而蛋白折叠可能导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和磁珠的作用力增加。可以用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，在样品及平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton X-100，或5~50%的甘油，可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，或使用钴离子螯合磁珠（AnnbeadsTM IDA-Cobalt）。此外，要获得纯度较高的蛋白

13.目标蛋白难洗脱

穿透组分中目标蛋白明显减少，而洗脱组分中目标蛋白很少，取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加热5~10min，离心跑电泳，如果发现较多蛋白残留。 （1）洗脱调节太温和。提高洗脱液咪唑浓度至700mM还不能洗脱时，可以尝试降低洗脱液pH至4.0，但低pH会也导致金属离子脱落，磁珠需要再生后再使用。 （2）蛋白吸附在磁珠上无法洗脱。对于非特异性疏水吸附的蛋白，可以增加N