His-tag蛋白不吸附或亲和力低是什么原因？

首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。 （1）有目标蛋白，但大量穿透： a、蛋白不含有标签或未能正确表达。 解决措施：Western Blot鉴定目标蛋白是否有His-Tag。若没有，需要重新构建载体，添加组氨酸标签，并确认标签正确表达。 b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露。 解决措施： 在样品和平衡缓冲缓冲液中加1-2M尿素，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不会变性。 在变性条件下纯化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M盐酸胍使蛋白变性。 如果蛋白有二硫键，最好加1-2mM DTT或1~5mM巯基乙醇（在样品中添加），可以改善蛋白的吸附。 重新构建载体，将组氨酸标签换到另外一端，或在组氨酸标签基因与目的基因之间增加一段Linker，可以降低蛋白折叠后标签被掩盖的几率。 c、标签太短。 解决措施：将标签的组氨酸数量增加至6-10个。 d、蛋白标签被水解。 解决措施：添加合适的蛋白酶抑制剂；尽量在低温下处理样品；对于分泌表达的蛋白，长时间存放将增加蛋白被降解的风险，应尽快处理样品。 e、蛋白溶解度偏低或聚集。 解决措施：在结合缓冲液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100，或5%~50%的甘油，可以增加蛋白的溶解度，减少蛋白聚集。 f、样品及结合缓冲液不合适：解决措施：确认样品及缓冲液中不含有EDTA、还原剂等。另外，将样品及结合缓冲液pH调节至7.4~8.5，有利于蛋白结合。 g、样品及结合缓冲液中咪唑浓度太高：解决措施：降低样品及结合缓冲液中的咪唑浓度。 （2）有目标蛋白，但含量很低： 蛋白表达量低。解决措施：对样品进行浓缩，增加磁珠用量、延长反应时间；优化表达条件（诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间，培养基等）；或更换其他合适的表达载体或表达系统。